کریسپر (CRISPR/Cas9) انقلابی در مهندسی ژنتیک و کاربردهای آن در تولید گیاهان مقاوم به شوری

کریسپر یک سیستم ایمنی ذاتی در باکتری‌ها برای مقابله با عوامل مهاجم مثل ویروس‌ها است که باعث تخریب ژنوم عامل مهاجم یعنی ویروس و نابودی آن می‌شود به زبان ساده‌تر، باکتری‌ها دائم توسط ویروس‌ها مورد حمله قرار می‌گیرند. یعنی در ابتدای پیدایش حیات، این باکتری‌ها و ویروس‌ها با هم در نبرد هستند. حال در این نبرد، یا ویروس پیروز می‌شود که سیستم باکتری را به کار می‌گیرد و به نفع خود استفاده می‌کند و یا اینکه باکتری پیروز می‌شود و نمی‌گذارد ویروس بر آن غلبه کند. زمانی که باکتری در مقابل ویروس پیروز می‌شود، بخشی از ژنوم ویروس را بر می‌دارد و به عنوان حافظه در آرشیوی به نام کریسپر در ژنوم خود ذخیره می‌کند تا زمانی که به کارش بیاید. حال کجا به کار می‌آید؟ زمانی که ویروس مجدداً به باکتری حمله می‌کند، باکتری یک نسخه کپی از آرشیو کریسپر تولید می‌کند و ژنوم ویروس را برای یافتن نسخه اصلی مورد اسکن قرار می‌دهد. زمانی که نسخه کپی با نسخه اصلی تطابق پیدا کرد با استفاده از یک سلاح قوی به نام کَس ۹ (cas۹) که یک آنزیم پروتئینی است، DNA ویروس را برش می‌دهد و موجب از بین رفتن ویروس می‌شود.

روش‌های متداول برای افزودن ابزارهای CRISPR به سلول‌ها

انتقال پلاسمیدها (برای باکتری‌ها)، الکتروپوریشن، تحریک شیمیایی یا تحویل ویروسی (برای سلول‌های انسانی)، انتقال آگروباکتریوم (برای گیاهان)،

نحوه عمل CRISPR

نوکلئازهای CRISPR مانند Cas9توالی هدف DNA را در یک فرآیند چند مرحله ای پیدا کرده و برش می دهند. هر پروتئین ساختار خاصی دارد – یک شکل یا معماری – که به آن اجازه می دهد کار خود را انجام دهد. یک RNA راهنما هر نوکلئاز CRISPR را به سمت توالی DNA یا RNA هدف هدایت می کند. توجه داشته باشید که از آنجایی که RNA به همان زبان ژنتیکی DNA نوشته می شود، RNA و DNA می توانند با یکدیگر جفت شوند و یک RNA راهنما می تواند با DNA یا RNA مکمل جفت شود.

Cas9 یک پروتئین منفرد و دو لوبی است که از چندین دمین ساخته شده است. Cas9 دو لوبی است که دمین های آن دو لوب را تشکیل می دهند: لوب تشخیص به اختصار (REC) و لوب هسته (NUC). لوب REC برای حمل RNA راهنما مهم است و لوب NUC شامل دو حوزه نوکلئاز مجزا به نام HNH و RuvC است.

برای یافتن جایگاه درست برش ، Cas9-gRNA دنبال توالی DNA مکمل است. اولین گام در فرآیند جستجو، جستجوی یک بخش کوتاهی از DNA است که برای Cas9 برای اتصال اهداف و برش لازم است به نام PAM است. PAM توسط ناحیه ای از نوکلئاز به نام PAM-PID شناسایی می شود. پروتئین Cas9 که به طور گسترده استفاده می شود از باکتری استرپتوکوک پیوژنز، توالی PAM، NGG “” را تشخیص می دهد. سایر نوکلئازهای CRISPR به PAMهای منحصر به فرد متصل می شوند زیرا آمینو اسیدهای متفاوتی در دمین های متصل شونده با PAM دارند.

پس از اتصال به PAM، Cas9 مارپیچ دوگانه DNA مجاور را باز می کند. اگر RNA راهنما با هدف مطابقت داشته باشد، با رشته DNA مکمل (رشته هدف) جفت می شود. جفت شدن همیشه در یک جهت اتفاق می افتد، از توالی هایی درست در کنار PAM، که به عنوان ناحیه seed شناخته می شود، شروع می شود و تا انتهای RNA راهنما جفت می شود. gRNA و DNA جفت شده در فضای بین لوب های REC و NUC قرار می گیرند. Cas9 به رشته مخالف یا غیرهدف در یک شیار در امتداد سطح آن متصل است و دو رشته DNA را از هم جدا نگه می دارد. اگر PAM وجود نداشته باشد یا DNA مجاور به طور کامل با RNA راهنما مطابقت نداشته باشد، Cas9 حرکت می کند و در جای دیگری جستجو می کند.

اگر Cas9 یک PAM را در کنار ناحیه‌ای از DNA پیدا کند که با RNA راهنمای آن مطابقت دارد، فرآیند برش یا شکافت DNA آغاز می‌شود. به طور کلی، تنها پس از هر 20 نوکلئوتید جفت باز RNA راهنما که با DNA هدف جفت می شود Cas9 برش را ایجاد می کند. زمانی که cas9 به PAM متصل می شود دو رشته DNA را از هم باز می کند تا sgRNA به توالی DNA مکمل خود وصل شود.

هنگامی که DNA هدف عمدتاً یا به طور کامل با توالی راهنما جفت شد، دامنه HNH در جای خود قرار می گیرد و رشته DNA هدف را قطع می کند. تقریباً بلافاصله پس از آن، دمین RuvC در جایگاه خود برای بریدن رشته DNA غیرهدف قرار می گیرد. دو برش در سه نوکلئوتید دورتر از PAM رخ می دهد.

مواد و تجهیزات لازم

پلیت کشت سلول، مستر میکس ها، بافر استخراج RNA، کیت استخراج DNA، کیت استخراج پلاسمید، سوش باکتری، دستگاهایی مانند PCR، ساتریفیوژ، ژل داک، تانک ژل و دستگاه الکتروفورز و…

مزایا و معایب:

تکنیک کریسپر (CRISPR/Cas9) به دلیل انعطاف پذیری و دقت بالای آن در برش و چسباندن DNA از محبوبیت ویژه ای برخوردار است، به این معنی که به محققان اجازه می دهد تا به راحتی توالی DNA را تغییر دهند و عملکرد ژن را اصلاح کنند. تکنیک کریسپر کاربردهای بالقوه زیادی دارد، از جمله اصلاح نقایص ژنتیکی، درمان و پیشگیری از گسترش بیماری ها و بهبود رشد و انعطاف پذیری محصولات. با این حال، این فناوری نگرانی‌ های اخلاقی را نیز ایجاد می‌کند.

این سیستم یک تکنولوژی مهندسی ژنوم همچنین با قابلیت تطبیق بسیار بالا در شرایط مختلف آزمایشگاهی و در سطح سلول های یوکاریوتی است. در واقع تکنیک کریسپر (CRISPR/Cas9) یک فناوری منحصر به فرد است که ژنتیک دانان و محققان پزشکی را قادر می سازد تا بخش هایی از ژنوم را با حذف، افزودن یا تغییر بخش هایی از توالی DNA ویرایش کنند.

استفاده از فناوری CRISPR برای تولید گیاهان مقاوم به شوری یکی از کاربردهای جالب و مهم آن در زمینه کشاورزی است. با استفاده از CRISPR، می‌توان ژنوم گیاهان را به گونه‌ای ویرایش کرد که آن‌ها به شوری خاک مقاومت بیشتری داشته باشند.

برخی از روش‌های استفاده از CRISPR برای تولید گیاهان مقاوم به شوری عبارتند از:

ویرایش ژن‌های مرتبط با تحمل شوری: با استفاده از CRISPR، می‌توان ژن‌های مرتبط با تحمل شوری را ویرایش کرده و گیاهان را به شوری خاک مقاومت بخشید.
افزایش ظرفیت گیاه برای جذب نمک: با ویرایش ژنوم، می‌توان ظرفیت گیاه برای جذب نمک را افزایش داد تا بتواند با شوری خاک مقابله کند.
تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها: CRISPR می‌تواند به تغییر فعالیت آنزیم‌های مرتبط با تحمل شوری در گیاهان کمک کند و آن‌ها را قادر به رشد در شرایط شورتر کند.
افزایش تولید مواد ضد استرس: با ویرایش ژنوم، می‌توان مواد ضد استرس در گیاهان افزایش داد تا آن‌ها در شرایط شورتر همچنان به خوبی رشد کنند.

به طور کلی، استفاده از CRISPR برای تولید گیاهان مقاوم به شوری می‌تواند به بهبود عملکرد و عمر مفید گیاهان در شرایط شور و پر نمک کمک کند و به کشاورزان کمک کند تا با چالش‌های این نوع خاک‌ها برخورد کنند. با این حال، نیاز به تحقیقات بیشتر و بررسی دقیق تأثیرات جانبی این تغییرات در طولانی مدت وجود دارد.

خلاصه ی یکی از تحقیقاتی که در این زمینه در گیاه گندم انجام شده و همچنین جدولی از تحقیقات در زمینه شوری در گیاهان مختلف در زیر آورده شده است:

گندم نان (Triticum aestivum L.، BBAADD) یک گونه آلو هگزاپلوید معمولی است و به طور کلی تحمل نمک بیشتری نسبت به اجداد گندم تتراپلوئید خود (BBAA) نشان می دهد. با این حال، اطلاعات کمی در مورد اساس مولکولی و مسیر تنظیمی این صفت وجود دارد. در اینجا، ما نشان می دهیم که هیستون استیل ترانسفراز TaHAG1 به عنوان یک تنظیم کننده حیاتی برای تقویت تحمل نمک گندم هگزاپلوید عمل می کند. بیان TaHAG1 ناشی از شوری با تنوع تحمل در گندم پلی پلوئیدی همراه بود. بیان بیش از حد، خاموش کردن، و حذف با واسطه CRISPR از TaHAG1 نقش TaHAG1 را در تحمل به شوری گندم تایید کرد. TaHAG1 با تعدیل تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و ویژگی سیگنال به تحمل نمک کمک کرد. علاوه بر این، TaHAG1 مستقیماً زیرمجموعه‌ای از ژن‌ها را هدف قرار داد که مسئول تولید پراکسید هیدروژن هستند و غنی‌سازی TaHAG1 باعث افزایش استیلاسیون H3 و تنظیم رونویسی این مکان‌ها تحت تنش شوری شد. علاوه بر این، ما متوجه شدیم که مسیر تولید ROS با واسطه TaHAG1 ناشی از شوری در تفاوت تحمل نمک در ترکیبات گندم با پلوئیدی متفاوت نقش دارد. یافته‌های ما بینشی را در مورد مکانیسم مولکولی ارائه می‌کند که چگونه یک عامل تنظیم‌کننده اپی ژنتیک سازگاری گندم پلی‌پلوئیدی را تسهیل می‌کند و این تعدیل‌کننده اپی ژنتیک را به عنوان یک استراتژی برای اصلاح تحمل به نمک در گندم نان برجسته می‌کند.

ویرایش ژنوم با استفاده از CRISPR برای شناسایی ژن‌های دخیل در پاسخ به شوری

Species	Target gene	Improved trait	Reference
Rice	RAV2	Enhance salinity tolerance	(Duan et al., 2016)
	MIR528	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(Zhou et al., 2017)
	SAPK1, SAPK2	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(Lou et al., 2018)
	BBS1	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(Zeng et al., 2018)
	DOF15	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(H. Qin et al., 2019)
	RR9, RR10	Enhance salinity tolerance	(W.-C. Wang et al., 2019)
	SPL10	Enhance salinity tolerance	(Lan et al., 2019)
	NCA1b	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(Bo et al., 2019)
	RR22	Enhance salinity tolerance	(A. Zhang et al., 2019)
	NCA1a, NCA1b	Reduced sensitivity	(J. Liu et al., 2019)
	GTg-2	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(X. Liu et al., 2020)
	PIL14	Reduced sensitivity of salt and improved tolerance	(Mo et al., 2020)
	PQT3	Enhance salinity tolerance	(Alfatih et al., 2020)
	BG3	Reduced sensitivity of salt	(Yin et al., 2020)
	FLN2	Reduced sensitivity of salt	(G. Chen et al., 2019)
	SOS1	Improved salinity tolerance	(Lu et al., 2021)
	Three ELF4 homologs	Reduced sensitivity	(Wang et al., 2021b)
	GI	Improved salt tolerance	(Wang et al., 2021b)
	BHLH024	Improved salt tolerance	(Alam et al., 2022)
Soybean	NHX5	Reduced sensitivity	(Sun et al., 2021)
Tomato	HAK20	Reduced sensitivity	(Z. Wang et al., 2020)
	HyPRP1	Enhanced salinity tolerance and stem length	(Tran et al., 2021)
	SOS1	Reduced sensitivity	(Wang et al., 2021c)
	ABIG1	Reduced sensitivity and improved tolerance	(Ding et al., 2022)
Wheat	Two HAG homologs	Enhanced salinity tolerance more chlorotic leaves	(Zheng et al., 2021)
Arabidopsis	C/VIF1	Enhanced salinity tolerance more chlorotic leaves	(Yang et al., 2020)
	SAUR41	Enhanced salinity tolerance more chlorotic leaves	(Qiu et al., 2020)
	ACQOS	Enhanced salinity tolerance more chlorotic leaves	(S.-T. Kim et al., 2021)
Barley	ITPK1	Enhanced salinity tolerance and reduced sensitivity	(Vlcko & Ohnoutkova, 2020)
Barley	HVP10	Reduced sensitivity	(Fu et al., 2022)
Cotton	AITR genes	Enhanced salinity tolerance	(Wang et al., 2021)
Maize	CLCg	Reduced sensitivity	(Luo et al., 2021)
	HKT1	Reduced sensitivity	(M. Zhang et al., 2018)
	STL1	Enhanced salinity tolerance	(Y. Wang et al., 2022)
Pumpkin	RBOHD	Reduced sensitivity	(Huang et al., 2019)